노화 세포 -갈락토시다아제 염색 키트

 

제품명	고양이 번호	투기.
노화 세포 -갈락토시다아제 염색 키트	G1073-100T	100 T

 

 

대부분의 정상 세포의 분열 능력은 제한되어 있습니다. 분열할 수 없으면 노화 상태에 들어가는데, 이를 세포 노화라고 합니다. 세포 노화는 세포가 자신의 성장 잠재력을 제어하는 ​​보장 메커니즘으로, 일반적으로 복제 노화를 의미합니다. 정상 세포는 제한된 수의 분열 후에 분열을 멈추고 비가역적인 성장 정지가 발생합니다. 이때 세포는 아직 살아있지만 세포 형태와 생리학적 대사 활동에 상당한 변화가 있으며, 일반적으로 노화와 관련된 세포 부피의 증가와 α-갈락토시다제의 활성화로 나타납니다. -갈락토시다아제는 세포 리소좀에 있는 가수분해 효소입니다. 일반적으로 pH 4.0에서 활성화되지만, 노화 세포에서는 pH 6.0에서 활성화됩니다. 본 키트는 이러한 현상과 원리를 바탕으로 노화와 관련된 α-갈락토시다제 활성 수준의 상향 조절에 대항하여 노화된 조직이나 세포를 염색하는 것입니다. 구체적인 반응 원리는 X-Gal을 기질로 사용하고 노화 세포 특이적 α-갈락토시다제가 기질을 촉매하여 청색 생성물을 생성하는 것입니다. 이는 광학 현미경으로 관찰할 수 있는 세포질의 청색 침전물로 표시됩니다. . 각 시료에 대한 염색액의 양을 1mL로 계산하면, 이 키트는 100개의 시료에 대한 염색을 완료할 수 있습니다.

 

 

젖은 얼음 운송; 빛으로부터 2-8도 떨어진 곳에 보관하세요. 12개월 동안 유효합니다. X-Gal 분말을 용액으로 제조할 경우 작은 조각으로 나누어 -20도에서 보관하면 3개월 이내에 효과가 나타난다.

 

 

구성요소 번호	요소	G1073
G1073-1	-갈락토시다아제 염색 고정액	100mL
G1073-2	-갈락토시다아제 염색 용액 A	100mL
G1073-3	-갈락토시다제 염색 B	1.2mL
G1073-4	DMF(디메틸포름아미드)	5mL
G1073-5	엑스갈(파우더)	100mg

 

 

시약의 준비

1. 자신만의 PBS 버퍼를 준비합니다(G4202 권장).

2. 100 mg X-Gal 분말을 완전히 용해시키고 5 mL DMF(디메틸포름아미드)와 혼합한 후 1.5 mL 깨끗한 원심분리 튜브에 각 튜브당 0.5 mL씩 나누어 {{8} } 빛으로부터 도 떨어져 있습니다. 반복적인 동결과 해동을 피하십시오.

3. 아래 표의 비율에 따라 α-갈락토시다아제 염색액을 준비합니다. 6-웰 플레이트에서 배양된 세포의 경우 웰당 1.0-1.5 mL의 염색 작업 용액이 필요하며, 12-웰 플레이트의 경우 0.{{8 }}.0 mL의 염색 작업 용액이 웰당 필요합니다. 낭비를 피하기 위해 염색 용액은 샘플 크기에 따라 준비되었습니다.

 

구성요소t	용량
- 갈락토시다아제 염색액 A	940 μL
-갈락토시다제 염색 B	10 μL
X - Gal 용액	50 μL
총량	1mL

 

 

1. 부착세포의 경우

(1) 6-웰 ​​플레이트에 배양된 세포(또는 세포 크롤링 시트)를 흡인하여 세포 배양 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 -갈락토시다제 염색 고정액 1 mL를 첨가한 후 세포를 세척하였다. 실온에서 15분 동안 고정시켰다.

(2) 고정된 용액을 버리고 세포를 PBS로 2분씩 3회 세척하였다.

(3) 피펫으로 PBS를 흡인 제거하고, 각 웰에 1 mL의 α-갈락토시다제 염색 작업 용액을 첨가한 후 37도에서 2시간에서 밤새 배양하였다. 참고: 37도의 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하지 마십시오. 염색기간 동안 발색의 경과를 시간에 따라 관찰하여야 한다. 검체 내 α-galactosidase의 발현이 높으면 몇 시간 내에 염색이 완료될 수 있습니다. -galactosidase 발현이 낮으면 배양 시간을 적절하게 연장해야 하며, 그 동안 6-웰 플레이트를 플라스틱 랩이나 파라필름으로 밀봉하여 액체 증발이 염색 결과에 영향을 미치지 않도록 해야 합니다.

(4) 일반 광학현미경으로 양성세포가 발색된 후 염색액을 제거하였다. 핵을 대조염색해야 하는 경우 소량의 Nuclear Fast Red 용액(G1035를 권장합니다) 웰 플레이트에 세포를 덮고 실온에서 3분간 염색한 후 염색액을 제거하고 PBS로 여러 번 세척합니다.

(5) 2 mL PBS를 첨가하여 세포를 덮고 염색을 완료했습니다. 샘플은 4도에서 1주일 동안 보관할 수 있습니다. 또는 70% 글리세롤을 추가하여 세포를 덮으면 4도 정도 오랫동안 보관할 수 있습니다. 셀 클라이밍 시트라면 완전히 건조가 가능하며, 중성검 씰 시트를 떨어뜨린 후 자일렌이 투명해 장기간 보관이 가능합니다.

2. 냉동절편의 경우

(1) 냉동된 부분을 실온에서 10분 동안 다시 데우십시오. 조직 스트로크로 조직에 동그라미를 치십시오.

(2) 조직에 적당량의 α-갈락토시다제 염색 고정액을 첨가하여 조직을 완전히 덮은 후 상온에서 20분간 고정시켰다.

(3) 조직 절편을 PBS에 담그고 매회 5분씩 3회 세척했습니다.

(4) 빛을 피하기 위해 절편을 젖은 상자에 넣고 적절한 양의 α-갈락토시다제 염색액을 조직에 첨가하여 조직을 완전히 덮었습니다. 젖은 상자를 37도에서 배양하고 2시간마다 현미경으로 발색을 관찰했습니다. 발색이 관찰되지 않으면 조직의 노화세포가 발색될 때까지 배양을 계속하였다. 검체를 밤새 배양해야 하는 경우, 염색 용액이 증발하여 정제가 건조되는 것을 방지하기 위해 충분한 양의 α-갈락토시다아제 염색 용액을 첨가해야 합니다.

(5) 조직이 발색된 후 염색액을 제거하고 절편을 PBS에 담가서 2회 세척한 후 순수에 담가서 2회 세척하였다.

(6) (선택 사항) Nuclear Fast Red 용액 추가(G1035를 권장합니다) 3분 동안 3회 세척합니다.

(7) 절편을 무수 에탄올로 2회 탈수시킨 후 매회 5분 동안 자일렌으로 투명하게 하고 중성 검 드롭으로 밀봉하였다.

3. 염색 결과

노화세포의 세포질은 파란색으로 흩어져 있다.

 

 

1. X-Gal 용액은 반드시 해동하여 실온에서 완전히 혼합한 후 사용하시기 바랍니다.

2. 갈락토시다제 염색액 A, B는 사용 전 미리 상온에 복원시켜 주시고, 준비된 염색액은 침전 없이 잘 혼합하여 사용하시기 바랍니다.

3. 노화 세포의 α-galactosidase 염색 반응은 특정 pH 조건에 따라 달라지므로 CO에서 배양할 수 없습니다.₂그렇지 않으면 염색 용액의 pH에 ​​영향을 미치고 염색 실패로 이어질 수 있습니다.

4. 염색액 준비시 폴리스티렌(PS) 대신 폴리프로필렌(PP)이나 유리 재질의 소모품을 선택하시기 바랍니다.

5. 발색은 하룻밤 발색 기간인 2시간 동안 여러 번 관찰해야 하며, 시간이 너무 짧으면 부정적인 결과가 발생할 수 있습니다. 시간이 너무 많으면 잘못된 긍정이 발생할 수 있습니다. 발색 시간은 시료 자체에 포함된 α-갈락토시다제의 양과 밀접한 관련이 있습니다.

6. 염색액을 준비하기 전 염색액 A의 pH 값을 확인하세요. 6이 아닌 경우0(보관 조건에 따라 달라질 수 있음), pH 값을 6으로 조정하세요.{{4} } 사용하기 전에 HCl 또는 NaOH와 함께 사용하십시오.

7. 조직 절편의 갈락토시다아제 염색에는 높은 수준의 샘플 준비가 필요하며, 샘플은 -80도에서 보관하고 가능한 한 빨리 테스트해야 합니다. -갈락토시다아제는 비활성화하기가 매우 쉽기 때문에 샘플을 부적절하게 보관하거나 샘플을 너무 오래 보관하면 효소가 비활성화되어 양성 염색이 되지 않을 수 있습니다.

8. 수술 중에는 실험복과 일회용 장갑을 착용해주세요.

 

이미지:

 

그림 1WI-38 세포는 -galactosidase 키트로 염색되었습니다. 왼쪽 그림은 노화 WI-38 세포가 분열 및 증식 능력은 없지만 여전히 살아있는 모습을 보여줍니다. 염색 후, 양성 염색 세포는 95% 이상이었습니다. 오른쪽 이미지는 3개 미만의 계대가 있는 새로 소생된 WI{5}} 세포(초기 계대)를 보여주며 염색 후 뚜렷한 양성 세포는 없습니다.

 

연구용으로만 사용하세요!

 

 

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