Click-iT EdU-594 세포 증식 분석 키트

 

제품명	Cat.No	투기.
Click-iT EdU-594 세포 증식 분석 키트	G1603	100 T

 

 

세포 증식 능력을 분석하여 특정 유전자, 약물 등이 in vitro에서 배양된 세포에 미치는 영향을 판단하거나, 다양한 상태에서 개별 조직 세포의 성장 및 재생 능력을 분석하는 것은 생명과학 분야에서 일반적이고 중요한 평가 방법입니다. 또는 자극 개입. . 현재 세포 증식을 검출하는 방법은 다양합니다. 대부분은 세포의 증식 활성을 간접적으로 평가하기 위해 세포에서 생성된 일부 대사 효소를 사용하지만(예: CCK-8 방법, MTT 방법 등) 일부 약물이나 세포 자체의 상태가 일정한 영향을 미칩니다. 평가 결과에 대해. 세포 증식을 결정하기 위해 세포 내 DNA 합성을 직접적으로 검출하는 것이 가장 정확하고 효과적인 검출 방법으로 인식되고 있습니다. 그러나 초기에 사용된 방사성 표지 뉴클레오시드 통합 방법과 항체 검출을 기반으로 한 후속 개선된 BrdU 방법에는 일정한 한계가 있습니다.

 

EdU(5-에티닐-2'-deoxyuridine)는 아세틸렌 그룹을 함유한 티미딘 유사체로, 동물에 주입하거나 시험관 내에서 세포와 함께 배양할 때 이 작은 분자는 다양한 기관과 조직으로 빠르게 확산되어 침투할 수 있습니다. 세포 내로 들어가며, 세포 증식 중에 티미딘(T) 대신 새로 합성된 DNA에 통합될 수 있습니다. EdU 분자의 아세틸렌 그룹은 구리 이온의 촉매 작용 하에서 형광 표지된 아지드 프로브와 "클릭" 반응을 거쳐 안정적인 트리아졸 고리를 형성할 수 있으므로 새로 합성된 DNA는 해당 형광 프로브로 표지될 수 있습니다. 방사성 표지된 뉴클레오시드 통합 방법과 비교하여 EdU 검출 방법은 방사성 오염과 같은 제한이 없습니다. BrdU 검출 방법에 비해 EdU 검출 방법은 DNA 변성 처리나 항원-항체 반응이 필요하지 않아 실험의 복잡도와 시간이 크게 줄어들고 시간 효율적이고 반응성이 뛰어나고 반응성이 우수합니다. 안정적이고 더 정확합니다. 이 키트는 시험관 내 또는 동물 조직에서 배양된 세포의 세포 증식을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 키트의 형광 프로브는 최대 여기 파장이 593 nm이고 최대 방출 파장이 614 nm인 적색 형광입니다. 증식하는 세포가 표지된 후 핵은 밝은 빨간색 형광을 나타내며 핵은 기존 핵 염료(Hoechst 33342 핵 염료가 이 키트에 제공됨)로 표지됩니다. 시험관 내 배양된 세포 집단의 형광 강도는 유세포 분석법으로도 검출할 수 있으며, 세포 주기의 S기에서의 DNA 복제 활성은 형광 강도에 따라 판단할 수 있습니다.

 

 

젖은 얼음으로 운송하십시오. 어둠 속에서 -20도에 보관하세요. EdU 촉매 시약(시약 A) 및 반응 완충액은 4도에서 보관할 수 있습니다. 유효기간은 12개월이다.

 

 

구성요소 번호	요소	G1603-100T
G1603-1	EdU 스토리지 솔루션(10mM)	100 μL
G1603-2	촉매(시약 A)	120 μL
G1603-3	형광염색 iF594(시약 B)	50 μL
G1603-4	촉매첨가제(시약 C)	2×100mg(분말)
G1603-5	반응 버퍼	20mL
G1603-6	Hoechst 33342 얼룩	30 μL
사용 설명서		1개

참고: 위의 반응 시간은 96-웰 플레이트 감지에 해당합니다.

 

 

1. 혈청 함유 세포 배양 배지;

2. 투과화 솔루션: 0.2-0.5% Triton X-100를 포함하는 버퍼(G1204 권장);

3. 고정액: 4% 파라포름알데히드(G1101 권장) 또는 기타 유사한 시약;

4. PBS 버퍼(G4202 권장);

5. 초순수;

6. 동물모델링 및 조직절편 관련 시약(동물조직 세포증식 검출)

 

 

1. 시험관 내 세포 샘플 및 시약 준비:

1.1. 세포를 세포배양판에 일정한 밀도로 고르게 식재(식재밀도는 세포의 크기, 성장속도 등에 따라 결정)하고, 세포가 벽에 부착되거나 정상상태로 돌아온 후, 해당 약물 자극 및 기타 처리(예: 현탁액 검출. 세포는 현탁액 세포의 일상적인 작동을 따르십시오. 전체 실험에는 원심분리와 같은 단계를 추가해야 합니다).

1.2. 촉매첨가제(시약 C)를 저속으로 원심분리한 후 초순수 1 mL에 녹인 후 나중에 사용하기 위해 -20도에 보관하였다.

2. 시험관 내 세포의 EdU 라벨링, 고정 및 투과성화:

2.1. 2× EdU 인큐베이션 작업 용액 준비: 20 μM 2× EdU 인큐베이션 작업 용액인 완전 세포 배양 배지 1 mL마다 2 μL EdU 스톡 용액(10 mM)을 첨가하고 인큐베이터에 넣어 예열합니다( 예비 실험에서 EdU 작업 농도 10μM로 탐색하는 것이 좋습니다.

2.2. 절반 배지 교환 방식에서는 배양 플레이트에 있는 원래 세포 배양 배지의 절반을 흡인으로 제거하고, 미리 예열된 2×EdU 배양 작업 용액을 동량으로 일정 시간 동안 첨가했습니다(인큐베이션 시간 일반적으로 해당 세포 성장에 따라 달라집니다). 세포주기는 일반적으로 세포주기의 약 10%를 차지합니다. 대부분의 부착성 및 빠르게 성장하는 세포의 경우 약 2시간 동안 배양하는 것이 좋습니다. 구체적인 상황은 세포의 특성과 치료 후 실제 상황에 따라 조정되어야 합니다. 장기간 배양해야 하는 경우 EdU의 작업 농도를 단기간 동안 적절하게 줄일 수 있습니다. EdU의 농도는 더 짧은 시간 동안 적절하게 증가할 수 있습니다.

2.3. EdU 라벨이 붙고 배양된 세포 샘플을 PBS 버퍼로 1-2회 세척하고 고정액을 추가하여 세포를 덮은 다음 실온에서 15분 동안 고정합니다(흐름 감지가 필요한 경우 이 단계 전에 세포를 부착합니다. 다이제스트 재현탁한 다음 고정한 다음 현탁된 세포의 처리 방법을 따릅니다. PBS 버퍼로 2-3회 세척합니다. 매번 3-5분씩 세척합니다.

2.4. PBS 버퍼를 제거하고 세포 또는 조직을 덮기 위해 투과화 용액을 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.

2.5. 투과화제를 제거한 후 매번 3-5분 동안 PBS 버퍼로 1-2회 세척한 후 4단계로 이동합니다.

3. Animal EdU 주입 모델링 및 조직 섹션 처리:

3.1. 실험 요구 사항에 따라 동물에게 복강 내 주사, 근육 내 주사, 피하 주사 및 꼬리 정맥 주사를 통해 하나 이상의 EdU 주사를 수행했습니다. 금액은 연구 내용과 동물의 상태에 따라 달라집니다. 이 키트는 체외에서 세포의 EdU 라벨링에 주로 사용되는 일부 EdU 보관 솔루션을 제공합니다. 동물에 EdU 모델링이 필요한 경우 EdU 시약(G5059 권장)을 별도로 주문할 수 있습니다.

3.2. 소장 등의 상피조직세포는 빠르게 증식하고, 뇌 등의 조직세포는 천천히 증식한다. 빠르게 성장하는 조직 부분은 일반적으로 12시간 미만 동안 표시되는 반면, 느리게 성장하는 조직은 표시되는 데 며칠이 걸릴 수 있습니다. 가장 좋은 마킹 시간은 특정 실험에 따라 다릅니다. 소장 상피 조직의 급속한 증식으로 인해 이러한 유형의 조직을 마커 참조로 사용하는 것이 좋습니다.

3.3. 규정된 기준에 따라 모델동물을 희생시킨 후, 필요한 조직을 꺼내고, 통상적인 절차에 따라 냉동 절편 또는 파라핀 절편을 제작하였다.

에이. 냉동 절편의 경우: 실온에 되돌린 후 적당량의 고정액을 첨가하고 실온에서 15분간 고정합니다. 고정액을 제거하고 매번 3-5분 동안 적절한 양의 PBS 버퍼로 3회 세척합니다. PBS 완충액을 제거하고 적절한 양의 투과성 용액을 사용하고 실온에서 10-15분 동안 배양합니다. 투과화 용액을 제거하고 PBS 버퍼로 1- 2회, 매번 3-5분 동안 세척한 후 4단계로 이동합니다.

비. 파라핀 섹션의 경우: 섹션을 파라핀 제거하고 다시 수분을 공급한 후 PBS로 5분 동안 세척합니다. PBS 완충액을 제거하고 투과화 용액을 추가한 후 세포나 조직을 덮고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 투과화 용액을 제거한 후 PBS 완충액으로 매번 3-5분 동안 1-2회 세척한 후 4단계로 이동합니다.

4. EdU 클릭 응답:

4.1. 세포 또는 조직 고정 및 천공 중에 클릭 반응 솔루션을 준비합니다(다양한 샘플 준비 시스템에 대해서는 아래 표의 프로토콜 참조).

시험관 내에서 배양된 세포의 경우: 이 참조 단계는 10 96-웰 플레이트 샘플의 부피(웰당 100μL)에 해당합니다. 사용의 필요에 따라 준비량을 같은 비율로 늘리거나 줄일 수 있습니다. 표에 표시된 순서대로 구성요소를 추가하세요. 가장자리를 추가하고 잘 섞습니다(현재 준비 및 사용).

 

요소	용량
반응 버퍼	935 μL
촉매(시약 A)	10 μL
형광염색 iF594(시약 B)	5 μL
촉매첨가제(시약 C)	50 μL
총량	1000 μL

 

조직 및 세포 슬라이스의 경우: 클릭 반응 용액 준비에 대해서는 아래 시스템을 참조하십시오. 준비량은 절단된 샘플 수에 따라 동일한 비율로 증가하거나 감소할 수 있습니다. 각 슬라이스 샘플은 약 100-200 μL의 클릭 반응 용액으로 덮여 있습니다.

 

요소	용량
반응 버퍼	928 μL
촉매(시약 A)	10 μL
형광염색 iF594(시약 B)	12 μL
촉매첨가제(시약 C)	50 μL
총량	1000 μL

 

4.2. 이전 단계(2.5 또는 3.3단계)에서 PBS 버퍼를 제거하고 클릭 반응 용액을 추가하고 부드럽게 흔들어 반응 용액이 세포 또는 조직을 완전히 덮도록 하고 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.

4.3. 클릭 반응 용액을 제거하고 매번 3-5분 동안 PBS 버퍼로 2-3회 세척합니다(다른 특별한 요구 사항이 없는 경우 유세포 분석기로 형광 강도를 감지하거나 형광 효과를 감지할 수 있습니다) 다른 악기에 의해).

5. 핵 염색:

5.1. 이전 단계에서 PBS 버퍼를 제거하고 Hoechst 33342 염색 용액과 PBS 버퍼를 1:500-1000의 비율로 희석하고 덮개 세포를 추가하고 5분 동안 배양합니다.

5.2. Hoechst 33342 염색 용액을 제거하고 PBS 완충액으로 2-3회, 매번 3-5분씩 세척합니다.

6. 이미징 및 검출 분석

증식하는 세포의 비율을 분석하기 위해 시험관 내에서 배양된 세포 또는 조직 절편 샘플을 형광 현미경 또는 공초점 현미경 및 기타 검출용 기기에 직접 배치하고; 또는 in vitro에서 배양된 세포를 수집하고 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 검출합니다(유세포 분석 검출을 위한 음성 대조군으로 EdU 표지된 세포 샘플을 사용하는 것이 권장되며 적절한 전압이 선택되었습니다). 세포주기의 S기에서의 DNA 복제 활성은 형광 강도에 따라 판단되었습니다. 이 키트의 형광 염료 iF594(시약 B)에 해당하는 스펙트럼 특성은 Ex/Em: 593 nm/614 nm(빨간색)입니다. Hoechst 33342 염색 용액에 해당하는 스펙트럼 특성은 Ex/Em: 346 nm/460 nm(파란색)입니다.

 

 

1. in vitro에서 배양된 세포의 경우, 시료 및 연구 목적에 따라 구체적인 EdU 농도 및 배양 시간을 적절하게 조정할 수 있습니다.

2. 일부 조직 세포는 천천히 증식합니다. 모델링 효과가 좋지 않은 등의 요인을 배제하기 위해 증식이 빠른 조직 샘플을 참조 샘플(예: 장 조직)로 선택하는 것이 좋습니다.

3. 배경색이 너무 어두우면 실험 중 세척이 충분하지 않은 경우, 조직 샘플의 고정 시간이 긴 경우, 고정액이 남아 있는 경우가 발생할 수 있습니다.

4. EdU 촉매 첨가 시약(시약 C)은 산화되기 쉬우므로 공기에 장기간 노출되지 않도록 하십시오. 수용액으로 조제된 후에는 별도의 포장으로 보관하는 것이 좋습니다. 테스트 후 EdU 촉매 첨가 시약의 색상이 약간 변경되면 클릭 반응 촉매 시스템은 동일하게 유지됩니다. 정상적으로 수행될 수 있으며, 갈색으로 변하면 구성 요소에 오류가 있음을 의미하므로 폐기하십시오.

5. 작업 중에는 실험복과 일회용 장갑을 착용하십시오.

 

연구용으로만 사용하세요!

 

 

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